Действие происходит в Риме, 17-18 июня 1800 года.
ДЕЙСТВИЕ I
Церковь Сант-Андреа дела Валле
Чезаре Анджелотти, консул бывшей Римской Республики, бежал из тюрьмы и скрывается в церкви Сант-Андреа дела Валле, в капелле Аттаванти. Художник Марио Каварадосси приходит в церковь работать и шокирует Ризничего, говоря, что написал портрет Марии Магдалины одновременно со своей возлюбленной, певицы Флории Тоски, и с маркизы Аттаванти. Маркиза во время молитвы оставила в фамильной капелле женскую одежду и ключ для своего брата Анджелотти. Когда Ризничий уходит, Анджелотти выходит из капеллы и сталкивается с Каварадосси. К счастью, художник сочувствует политическим взглядам беглеца и обещает помочь ему. Снаружи доносится голос Тоски, окликающего своего любовника; Анджелотти прячется.
Тоска думает, что Каварадосси разговаривал с женщиной. Художник уверяет её, что это не так, но Тоска узнаёт в Марии Магдалине черты маркизы Аттаванти и снова ревнует. Когда певица уходит, Каварадосси говорит Анджелотти, что спрячет его на своей вилле, и мужчины покидают церковь.
Возвращается Ризничий с известием – ложным, как выяснится позже, – о поражении Наполеона при Маренго. В честь этого в церкви исполнят праздничный «Te Deum», а вечером Тоска будет петь в Палаццо Фарнезе. Ликование прерывается явлением Скарпиа, зловещего шефа полиции. Он и его агент Сполетта проследили Анджелотти до этой церкви. Найдя пустую обеденную корзину Каварадосси и обронённый веер с гербом Аттаванти, Скарпиа убеждается, что Каварадосси помог Анджелотти бежать.
Снова приходит Тоска, и вожделеющий её Скарпиа подогревает её ревность, показывая ей веер и намекая, что Каварадосси изменяет ей с маркизой Аттаванти. Тоска спешит на виллу Каварадосси, и Скарпиа приказывает Сполетте следовать за ней. Под звуки «Te Deum» Скарпиа предаётся мыслям о том, как казнит Каварадосси и овладеет Тоской.
ДЕЙСТВИЕ II
Апартаменты Скарпиа в Палаццо Фарнезе
Скарпиа посылает Тоске записку с просьбой прийти к нему. Сполетта признаётся, что ему не удалось найти Анджелотти, но он арестовал Каварадосси. Скарпиа допрашивает Каварадосси, а за окном слышно пение Тоски, исполняющей кантату. Каварадосси всё отрицает, и Скарпиа велит его пытать. Приходит Тоска. Скарпиа допрашивает её и приказывает открыть дверь пыточной, чтобы она слышала крики своего любовника. Наконец Тоска выдаёт, где прячется Анджелотти. В комнату приносят раненого Каварадосси, и Скарпиа говорит ему, что Тоска его выдала. Входит полицейский Шарроне и докладывает, что Наполеон всё же одержал победу при Маренго. Каварадосси бурно радуется, его утаскивают прочь.
Тоска умоляет Скарпиа и в конце концов соглашается отдаться ему в обмен на освобождение Каварадосси. Скарпиа зовёт своего помощника Сполетту и делает вид, что казнь будет произведена холостыми патронами. Затем он выписывает пропуск, позволяющий влюблённым покинуть Рим, и поворачивается к Тоске. Но как только он пытается её обнять, она ударяет его ножом. Тоска берёт пропуск, расставляет свечи вокруг мёртвого тела Скарпиа и уходит.
ДЕЙСТВИЕ III
Замок святого Ангела
Светает. Каварадосси пытается написать Тоске прощальное письмо, но его захлёстывают воспоминания о ней. Тут приходит Тоска и рассказывает любимому, что убила Скарпиа. Влюблённые мечтают о счастливом будущем, Тоска учит Каварадосси, как правильно падать во время псевдоказни. Когда расстрельный взвод даёт залп, она отмечает, как хорошо Каварадосси изобразил падение – но когда солдаты уходят, оказывается, что Скарпиа обманул её, и Каварадосси погиб. Вбегают Сполетта и Шарроне, чтобы арестовать Тоску за убийство Скарпиа, но прежде чем они успевают её схватить, Тоска прыгает с парапета замка навстречу смерти.